Colture cellulari. Omogenizzazione e centrifugazione. Spettrofotometria e fluorimetria: principio e applicazioni. Tecniche cromatografiche. Elettroforesi. Radioisotopi: Anticorpi mono e policlonali. Dosaggi enzimatici e di metaboliti. Enzimi immobilizzati. Tecnica del DNA ricombinante.
BIOCHIMICA E BIOLOGIA MOLECOLARE: PRINCIPI E TECNICHE
K. Wilson e J. Wwalker
Raffaello Cortina Editore
INGEGNERIA GENETICA
Boncinelli Simeone
Idelson Napoli
METODOLOGIE DI BASE PER LE SCIENZE BIOMOLECOLARI
R. Reed, D. Holmes, J. Weyers, A.Jones
Zanichelli
Inoltre sono disponibili sulla piattaforma Moodle le presentazioni in pdf delle lezioni
Obiettivi Formativi
Il corso di Biochimica Applicata si propone di fornire le conoscenze teorico-pratiche delle principali metodologie biochimiche, utili alla caratterizzazione e alla regolazione delle vie metaboliche, e delle strumentazioni necessarie per la separazione, l’identificazione e l’analisi delle biomolecole
Prerequisiti
Frequenza dei due terzi del corso e l'esame di Biochimica
Metodi Didattici
Le lezioni teoriche in cui sono presentate le varie metodiche sono affiancate da brevi esercitazioni dimostrative
Altre Informazioni
Orario di ricevimento
Tutti i giorni previo appuntamento
Recapito: Dipartimento di Scienze Biomediche Sperimentali e Cliniche
Viale Morgagni, 50, 50134 Firenze
Tel. 055/4598330
e-mail: tiantomasi@unifi.it
vincenzini@unifi.it
Modalità di verifica apprendimento
La prova di accertamento é orale ed ha lo scopo di accertare la conoscenza teorica dello studente sulle metodologie e le strumentazioni analizzate
Programma del corso
Colture cellulari. Omogeneizzazione e centrifugazione. Spettrofotometria e fluorimetria: principio e applicazioni. Tecniche cromatografiche. Elettroforesi. Radioisotopi: Anticorpi mono e policlonali. Dosaggi enzimatici e di metaboliti. Enzimi immobilizzati. Tecnica del DNA ricombinante.
Approcci alla sperimentazione e alla messa a punto di strategie di purificazione. Principali substrati utilizzati nella sperimentazione.
Colture cellulari: linee cellulari primarie e stabilizzate. Inibizione da contatto e conteggio cellulare. Terreni di coltura, incubatori e cappe a flusso laminare.
Tecniche di omogeneizzazione in mezzo solido o liquido. Frullatori, Potter e Ultra Turrax. Tecniche di centrifugazione. Metodi di rottura delle cellule.
Campo centrifugo e velocità di centrifugazione. Coefficiente di sedimentazione. Centrifugazione differenziale, zonale di velocità ed isopicnica. Rotori utilizzati.
Spettroscopia di Assorbimento UV-VIS: principi fisici dell'assorbimento di una radiazione elettromagnetica; legge di Lambert-Beer; strumentazione e applicazioni. Spettrofotometria: legge di Lambert e Beer e sue applicazioni. Metodi colorimetrici per dosaggio di proteine. Fotometri e spettrofotometri.
Spettroscopia di Fluorescenza: principi fisici del fenomeno; strumentazione e applicazioni.
Radioisotopi: legge del decadimento radioattivo. Emettitori α, γ. Determinazione della radioattività mediante ionizzazione di un gas, scintillazione liquida e solida e autoradiografia.
Anticorpi policlonali: immunizzazione e produzione di antisieri. Proprietà degli anticorpi monoclonali. Dosaggi radioimmunologici (RIA) e immunoenzimatici (EIA). Studio del trasporto transmembrana con l’uso degli isotopi
Tecniche cromatografiche: Coefficiente di ripartizione e piatti teorici. Cromatografia su colonna su carta e su strato sottile. Vari tipi di cromatografia: scambio ionico, ad esclusione e d’affinità. Rivelazione, identificazione e quantificazione dei composti separati. Elettroforesi di proteine e degli acidi nucleici: principio della tecnica; SDS-PAGE; Isolectrofocusing, elettroforesi capillare. Purificazione e determinazione del peso molecolare di proteine.
Enzimi: analisi qualitativa e quantitativa. Determinazione della velocità iniziale e dell’attività specifica. Preparazione della miscela di dosaggio. Determinazione dei parametri cinetici. Dosaggio di metaboliti nella diagnostica. Enzimi immobilizzati.
Acidi nucleici: sequenzamento e sintesi chimica. Tecnica del DNA ricombinante: enzimi di restrizione, vettori di clonazione e di espressione. Amplificazione in vitro del DNA (PCR) -Sintesi enzimatica di cDNA da mRNA. Produzione di proteine ricombinanti: somatostatina, insulina, ormone somatotropo, vaccini. Tecniche di terapia genica.