B016589 - BIOCHIMICA APPLICATA

Italiano

Colture cellulari. Omogenizzazione e centrifugazione. Spettrofotometria e fluorimetria: principio e applicazioni. Tecniche cromatografiche. Elettroforesi. Radioisotopi: Anticorpi mono e policlonali. Dosaggi enzimatici e di metaboliti. Enzimi immobilizzati. Tecnica del DNA ricombinante

BIOCHIMICA E BIOLOGIA MOLECOLARE: PRINCIPI E TECNICHE
K. Wilson e J. Wwalker
Raffaello Cortina Editore

INGEGNERIA GENETICA
Boncinelli Simeone
Idelson Napoli

METODOLOGIE DI BASE PER LE SCIENZE BIOMOLECOLARI
R. Reed, D. Holmes, J. Weyers, A.Jones
Zanichelli

Inoltre sono disponibili sulla piattaforma Moodle le presentazioni in pdf delle lezioni

Le lezioni teoriche in cui sono presentate le varie metodiche sono affiancate da brevi esercitazioni dimostrative

Orario di ricevimento
Tutti i giorni previo appuntamento
Recapito: Dipartimento di Scienze Biomediche Sperimentali e Cliniche
Viale Morgagni, 50, 50134 Firenze
Tel. 055/2751257
e-mail: tiantomasi@unifi.it

E’ previsto un appello al mese eccetto che nei mesi di maggio e agosto. Lo studente, che per sostenere l’esame di Biochimica Applicata deve aver sostenuto quello di Biochimica, se non supera l’esame può riscriversi all’appello del mese successivo. L’esame può all’incirca avere la durata di 45 min e consiste nell’esposizione orale dei concetti relativi agli argomenti oggetto delle lezioni, per verificare che lo studente abbia acquisito le conoscenze teoriche delle metodologie e delle strumentazioni analizzate con chiaro riferimento all’applicazione pratica. La capacità di adottare una certa strategia sperimentale, per lo studio quantitativo e qualitativo delle molecole e per la valutazione di processi metabolici, sarà valutata in base a tutte le considerazioni che lo studente è in grado di fare tenendo conto di specifici criteri e problematiche che spingono a decidere di usare determinate strumentazioni e tecniche piuttosto che altre.

Colture cellulari. Omogeneizzazione e centrifugazione. Spettrofotometria e fluorimetria: principio e applicazioni. Tecniche cromatografiche. Elettroforesi. Radioisotopi: Anticorpi mono e policlonali. Dosaggi enzimatici e di metaboliti. Enzimi immobilizzati. Tecnica del DNA ricombinante.
Approcci alla sperimentazione e alla messa a punto di strategie di purificazione. Principali substrati utilizzati nella sperimentazione.
Colture cellulari: linee cellulari primarie e stabilizzate. Inibizione da contatto e conteggio cellulare. Terreni di coltura, incubatori e cappe a flusso laminare.
Tecniche di omogeneizzazione in mezzo solido o liquido. Frullatori, Potter e Ultra Turrax. Tecniche di centrifugazione. Metodi di rottura delle cellule.
Campo centrifugo e velocità di centrifugazione. Coefficiente di sedimentazione. Centrifugazione differenziale, zonale di velocità ed isopicnica. Rotori utilizzati.
Spettroscopia di Assorbimento UV-VIS: principi fisici dell'assorbimento di una radiazione elettromagnetica; legge di Lambert-Beer; strumentazione e applicazioni. Spettrofotometria: legge di Lambert e Beer e sue applicazioni. Metodi colorimetrici per dosaggio di proteine. Fotometri e spettrofotometri.
Spettroscopia di Fluorescenza: principi fisici del fenomeno; strumentazione e applicazioni.
Radioisotopi: legge del decadimento radioattivo. Emettitori α,  γ. Determinazione della radioattività mediante ionizzazione di un gas, scintillazione liquida e solida e autoradiografia.
Anticorpi policlonali: immunizzazione e produzione di antisieri. Proprietà degli anticorpi monoclonali. Dosaggi radioimmunologici (RIA) e immunoenzimatici (EIA). Studio del trasporto transmembrana con l’uso degli isotopi
Tecniche cromatografiche: Coefficiente di ripartizione e piatti teorici. Cromatografia su colonna su carta e su strato sottile. Vari tipi di cromatografia: scambio ionico, ad esclusione e d’affinità. Rivelazione, identificazione e quantificazione dei composti separati. Elettroforesi di proteine e degli acidi nucleici: principio della tecnica; SDS-PAGE; Isolectrofocusing, elettroforesi capillare. Purificazione e determinazione del peso molecolare di proteine.
Enzimi: analisi qualitativa e quantitativa. Determinazione della velocità iniziale e dell’attività specifica. Preparazione della miscela di dosaggio. Determinazione dei parametri cinetici. Dosaggio di metaboliti nella diagnostica. Enzimi immobilizzati.
DNA ricombinante: enzimi di restrizione, vettori di clonaggio e di espressione. Sequenziamento e amplificazione in vitro (PCR del DNA) Sintesi enzimatica di cDNA da mRNA. Produzione di proteine ricombinanti: somatostatina, insulina, ormone somatotropo, vaccini. Tecniche di terapia genica.