Colture cellulari. Omogenizzazione e centrifugazione. Spettrofotometria e fluorimetria: principio e applicazioni. Tecniche cromatografiche. Elettroforesi. Radioisotopi: Anticorpi mono e policlonali. Dosaggi enzimatici e di metaboliti. Enzimi immobilizzati. Tecnica del DNA ricombinante.
BIOCHIMICA E BIOLOGIA MOLECOLARE: PRINCIPI E TECNICHE
K. Wilson e J. Wwalker
Raffaello Cortina Editore
INGEGNERIA GENETICA
Boncinelli Simeone
Idelson Napoli
METODOLOGIE DI BASE PER LE SCIENZE BIOMOLECOLARI
R. Reed, D. Holmes, J. Weyers, A.Jones
Zanichelli
Inoltre sono disponibili sulla piattaforma Moodle le presentazioni in pdf delle lezioni
Prerequisiti
Per sostenere l'esame è necessario aver sostenuto quello di Biochimica
Metodi Didattici
Le lezioni teoriche relative alle varie metodiche sono affiancate da brevi esercitazioni dimostrative
Altre Informazioni
Orario di ricevimento
tutti i giorni previo appuntamento
Recapito: Dipartimento di Scienze Biomediche Sperimentali e Cliniche
Viale Pieraccini, 6, 50139 Firenze
Tel. 055/2758146
e-mail: tiantomasi@unifi.it
Modalità di verifica apprendimento
E’ previsto un appello al mese eccetto che nei mesi di maggio e agosto. Lo studente se non supera l’esame può riscriversi all’appello del mese successivo. L’esame può all’incirca avere la durata di 45 min e consiste nell’esposizione orale dei concetti relativi agli argomenti oggetto delle lezioni al fine di verificare l'acquisizione, da parte dello studente, delle conoscenze teoriche delle metodologie e delle strumentazioni analizzate con chiaro riferimento all’applicazione pratica. La capacità di adottare una certa strategia sperimentale, per lo studio quantitativo e qualitativo delle molecole e per la valutazione di processi metabolici, sarà valutata in base a tutte le considerazioni che lo studente è in grado di fare tenendo conto di specifici criteri e problematiche che spingono a decidere di usare determinate strumentazioni e tecniche piuttosto che altre.
Programma del corso
Introduzione al corso. Apprcci all sperimentazione e allo sviluppo di strategie da adottare per la purificazione di molecole biologiche. Principali substrati usati nella sperimentazione "in vitro" e "in vivo". Colture cellulari. Omogeneizzazione e centrifugazione. Spettrofotometria e fluorimetria: principio e applicazioni. Tecniche cromatografiche. Elettroforesi. Radioisotopi: Anticorpi mono e policlonali. Dosaggi enzimatici e di metaboliti. Enzimi immobilizzati. Tecnica del DNA ricombinante.
Approcci alla sperimentazione e alla messa a punto di strategie di purificazione. Principali substrati utilizzati nella sperimentazione.
Colture cellulari: linee cellulari primarie e stabilizzate. Inibizione da contatto e conteggio cellulare. Terreni di coltura, incubatori e cappe a flusso laminare.
Tecniche di omogeneizzazione in mezzo solido o liquido. Frullatori, Potter e Ultra Turrax. Tecniche di centrifugazione. Metodi di rottura delle cellule.
Campo centrifugo e velocità di centrifugazione. Coefficiente di sedimentazione. Centrifugazione differenziale, zonale di velocità ed isopicnica. Rotori utilizzati.
Spettroscopia di Assorbimento UV-VIS: principi fisici dell'assorbimento di una radiazione elettromagnetica; legge di Lambert-Beer; strumentazione e applicazioni. Spettrofotometria: legge di Lambert e Beer e sue applicazioni. Metodi colorimetrici per dosaggio di proteine. Fotometri e spettrofotometri.
Spettroscopia di Fluorescenza: principi fisici del fenomeno; strumentazione e applicazioni.
Radioisotopi: legge del decadimento radioattivo. Emettitori α, γ. Determinazione della radioattività mediante ionizzazione di un gas, scintillazione liquida e solida e autoradiografia.
Anticorpi policlonali: immunizzazione e produzione di antisieri. Proprietà degli anticorpi monoclonali. Dosaggi radioimmunologici (RIA) e immunoenzimatici (EIA). Studio del trasporto transmembrana con l’uso degli isotopi
Tecniche cromatografiche: Coefficiente di ripartizione e piatti teorici. Cromatografia su colonna su carta e su strato sottile. Vari tipi di cromatografia: scambio ionico, ad esclusione e d’affinità. Rivelazione, identificazione e quantificazione dei composti separati. Elettroforesi di proteine e degli acidi nucleici: principio della tecnica; SDS-PAGE; Isolectrofocusing, elettroforesi capillare. Purificazione e determinazione del peso molecolare di proteine.
Enzimi: analisi qualitativa e quantitativa. Determinazione della velocità iniziale e dell’attività specifica. Preparazione della miscela di dosaggio. Determinazione dei parametri cinetici. Dosaggio di metaboliti nella diagnostica. Enzimi immobilizzati.
DNA ricombinante: enzimi di restrizione, vettori di clonaggio e di espressione. Sequenziamento e amplificazione in vitro (PCR del DNA) Sintesi enzimatica di cDNA da mRNA. Produzione di proteine ricombinanti: somatostatina, insulina, ormone somatotropo, vaccini. Tecniche di terapia genica.
Obiettivi Agenda 2030 per lo sviluppo sostenibile
Salute e benessere
Industria, innovazione e infrastrutture
Consumo e produzione responsabili