Conoscenza delle tecniche e metodologie di base della biochimica applicata per la identificazione e analisi di biomolecole in campioni biologici. Tecnologie molecolari per la produzione e ingegnerizzazione di proteine ricombinanti con applicazioni biotecnologiche anche in campo medico e farmaceutico.
Applicazioni delle metodologie biochimiche e molecolari per lo studio delle basi biochimiche degli stati patologici.
Metodologie biochimiche
Maria Carmela Bonaccorsi Di Patti, Roberto Contestabile, Martino Luigi Di Salvo
Ed Zanichelli ISBN: 9788808712448
M.Maccarrone – Metodologie biochimiche e biomolecolari. Strumenti e tecniche per il laboratorio del nuovo millennio. Zanichelli 2019
Obiettivi Formativi
Il corso si prefigge l'obiettivo di istruire lo studente relativamente ai principi generali della Biochimica applicata e molecolare. Il corso fornisce competenze teoriche e scientifiche per lo studio delle principali biomolecole e dei parametri biochimici in campioni biologici anche in rapporto ai diversi stati fisiopatologici dell'uomo.
Prerequisiti
Il corso richiede conoscenze di biochimica generale e molecolare.
Metodi Didattici
lezioni in presenza
Modalità di verifica apprendimento
La verifica dell'apprendimento avviene attraverso il solo esame finale, che accerta l'acquisizione delle conoscenze apprese. L'esame finale consiste in una prova orale volta ad accertare la conoscenza delle tecniche biochimiche e molecolari di base e alla conoscenza dell'applicazione delle tecniche biochimiche e molecolare per il monitoraggio dei parametri fisiopatologici nell'uomo. Sarà valutata la capacità di ragionamento e l'utilizzo di un lessico specializzato. La votazione finale risulta dall'insieme di questi contributi considerati importanti indicatori della adeguatezza del livello di apprendimento conseguito e del raggiungimento dei risultati di apprendimento previsti dal corso.
Programma del corso
Spettrofotometria. Leggi dell'assorbimento della luce. Saggi colorimetrici. Spettrofluorimetria: principi e applicazioni. Luminescenza: principi e applicazioni. Dosaggio del contenuto proteico in campioni biologici con vari metodi colorimetrici. Preparazione e manipolazione di campioni biologici. Rottura di cellule; preparazione e purificazione di organelli cellulari. Centrifugazione per separazione di organelli cellulari, purificazione di acidi nucleici. Cenni di colture cellule eucariotiche e batteri. La cinetica enzimatica. Equazione di Michaelis-Menten. Cinetica enzimatica applicazioni e pratica. Metodi di dosaggio degli enzimi. Dosaggio di analitici con metodo enzimatico. Principi ed applicazioni della dry-chemistry. Caratteristiche degli anticorpi. Tecniche immunochimiche. Produzione di Anticorpi mono e poli-clonali. Applicazioni: dosaggi RIA e ELISA, immunoistochimica. Tecniche elettroforetiche: concetto di mobilità elettroforetica e relazione tra mobilità, carica, campo elettrico applicato, dimensioni. Relazione tra punto isoelettrico e mobilità delle proteine Elettroforesi per proteine in condizioni native o denaturanti. Isoelettrofocalizzazione, Elettroforesi mono e bidimensionale. Western-blotting. Procedure per la purificazione delle proteine: considerazioni generali, precipitazione frazionata delle proteine (salting in and salting out). Tecniche cromatografiche: generalità e definizioni. Caratteristiche ed applicazioni delle cromatografie: di scambio ionico, di esclusione dimensionale (con esempi di determinazione del peso molecolare di proteine), di cromatografia di affinità (con esempi di ligandi e strategie generali per il legame covalente dei ligandi alla fase stazionaria. Esempi di strategie di purificazione di proteine.
Tecnologia del DNA ricombinante. Le tecniche di base del clonaggio del DNA. Tecniche per l'identificazione di acidi nucleici e DNA. Microarray. Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR), RT-PCR. Applicazioni della tecnica della PC R. Sstudio della espressione genica. Elettroforesi di acidi nucleici. Produzione e purificazione di proteine ricombinati ed esempi di applicazioni farmacologiche. Introduzione alla tecnica del phage-display. Produzione di Anticorpi ricombinanti umani ( ScFv e hVH).
Applicazioni delle metodologie biochimiche in campo medico e farmaceutico.
Separazione elettroforetica delle catene di emoglobina. Separazione elettroforetica delle Proteine seriche. Dosaggio elettroforetici e immunologici. . Metodi per il monitoraggio delle proteine della coagulazione. Dosaggio di Lipidi e lipoproteine. Metodi di laboratorio per il dosaggio dei principali lipidi. Metodi di laboratorio per il dosaggio del glucosio e sue applicazioni. Glucometri.
Dosaggi corpi chetonici. Dosaggio di Mioglobina. Creatina Chinasi. Isoenzimi della LDH. Troponine. Metodi di dosaggi degli ormoni. Ormoni pancreatici. Ghiandole surrenali. Ormoni tiroidei. Ipotalamo. Dosaggi delle diverse Transaminasi. Misurazioni di bilirubina. Misurazione della creatinina. Dosaggio di Urea e acido urico. Introduzione ai markers tumorali ed esempi di dosaggio immunoenzimatici o con tecniche di biologia molecolare. Applicazione delle tecniche immuno-cromatografiche. Dosaggio di droghe d'abuso in urine e altri fluidi biologici.