Colture cellulari. Omogenizzazione e centrifugazione. Spettrofotometria e fluorimetria: principio e applicazioni. Tecniche cromatografiche. Elettroforesi. Radioisotopi: Anticorpi mono e policlonali. Dosaggi enzimatici e di metaboliti. Enzimi immobilizzati. Tecnica del DNA ricombinante. Farmaci ricombinanti
BIOCHIMICA E BIOLOGIA MOLECOLARE: PRINCIPI E TECNICHE
K. Wilson e J. Wwalker
Raffaello Cortina Editore
INGEGNERIA GENETICA
Boncinelli Simeone
Idelson Napoli
METODOLOGIE DI BASE PER LE SCIENZE BIOMOLECOLARI
R. Reed, D. Holmes, J. Weyers, A.Jones
Zanichelli
Biochimica clinica essenziale
Elisabetta Albi con Tommaso Beccari e samuela Cataldi
Zanichelli
Obiettivi Formativi
L'obiettivo del corso è fornire conoscenze su metodiche, strumentazioni e protocolli sperimentali necessari per studiare la struttura, l'organizzazione e la funzione delle molecole che costituiscono la materia vivente
Prerequisiti
Per sostenere l'esame è necessario aver sostenuto tutti quelli del primo anno e quello di Biochimica
Metodi Didattici
Lezioni frontali in aula e ricevimenti per chiarimenti se richiesti.
Pc e proiettore sono usati come supporto alla didattica.
Inoltre sono disponibili sulla piattaforma Moodle le presentazioni in pdf delle lezioni
Altre Informazioni
Orario di ricevimento
tutti i giorni previo appuntamento
Recapito: Dipartimento di Scienze Biomediche Sperimentali e Cliniche
Viale Pieraccini, 6, 50139 Firenze
Tel. 055/2758146
e-mail: teresa.iantomasi@unifi.it
Modalità di verifica apprendimento
In linea di massima è previsto un appello al mese eccetto che nei mesi di maggio e agosto. Lo studente che non supera l’esame può sostenerlo all’appello successivo. L’esame si svole in circa 45 min e consiste nell’esposizione orale dei concetti relativi agli argomenti oggetto delle lezioni al fine di verificare l'acquisizione, da parte dello studente, delle conoscenze teoriche delle metodologie e delle strumentazioni analizzate con chiaro riferimento all’applicazione pratica. La capacità di adottare una certa strategia sperimentale, per lo studio quantitativo e qualitativo delle molecole e per la valutazione di processi metabolici, sarà valutata in base a tutte le considerazioni che lo studente è in grado di fare tenendo conto di specifici criteri e problematiche che spingono a decidere di usare determinate strumentazioni e tecniche piuttosto che altre.
Programma del corso
Introduzione al corso: approcci alla sperimentazione e alla messa a punto di strategie per la purificazione di molecole biologiche. Principali substrati usati nella sperimentazione "in vitro" e "in vivo".
Colture cellulari: linee cellulari primarie e stabilizzate. Inibizione da contatto e conteggio cellulare. Piastre, pipette, terreni di coltura, incubatori e cappe a flusso laminare.
Tecniche di omogeneizzazione in mezzo solido o liquido. Frullatori, Potter e Ultra Turrax, sonicatore. Metodi di rottura delle cellule
Tecniche di centrifugazione: campo centrifugo e velocità di centrifugazione. Centrifughe. Centrifugazione differenziale e su gradiente. Rotori ad angolo fisso, oscillanti e rotori zonali.
Spettroscopia di Assorbimento UV-VIS. Determinazioni qualitative e quantitative. Legge di Lambert-Beer e sua applicazione. Fotometri e spettrofotometri. Metodi colorimetrici.
Spettroscopia di Fluorescenza: relazione con la concentrazione. Efficienza quantica e quenching. Strumentazione e applicazioni.
Cenni di nefelometria e turbidimetria. Monitoraggio dei fattori della coagulazione.
Radioisotopi: legge del decadimento radioattivo. Emettitori α, β e γ. Determinazione della radioattività. Uso dei radioisotopi nella sperimentazione biochimica e in medicina nucleare. Cenni su radiofarmaci.
Anticorpi: immunizzazione e produzione di antisieri policlonali. Proprietà degli anticorpi monoclonali e loro preparazione con ibridomi e tecniche di ingegneria genetica. Anticorpi chimerici, umanizzati e umani. Anticorpi monoclonali come farmaci. Agglutinazione e dosaggio del titolo anticorpale e della proteina C reattiva. Dosaggi radioimmunologici (RIA) e radioimmunometrici (IRMA). Immunofluorescenza.
Tecniche cromatografiche: Coefficiente di ripartizione e piatti teorici. Cromatografia su colonna su carta e su strato sottile. Cromatografia d’adsorbimento, a scambio ionico, ad esclusione, d'affinità. HPLC. Test immunocromatografici a flusso laterale o test rapidi.
Elettroforesi: Velocità di migrazione. Mobilità elettroforetica. Elettroforesi di proteine e degli acidi nucleici. SDS-PAGE. Isolettrofocalizzazione. Elettroforesi capillare. Separazione elettroforetica delle sieroproteine e delle catene dell’emoglobina.
Dosaggi enzimatici. Determinazione della velocità iniziale e dell'attività specifica. Determinazione spettrofotometrica dell’attività enzimatica con metodi continui e discontinui. Enzimi come farmaci. Dosaggi enzimatici nel siero a scopo diagnostico: transaminasi, lattico deidrogenasi e suoi isoenzimi, creatina kinasi, fosfatasi alcalina, amilasi, lipasi.
Dosaggio di metaboliti. Metodo a termine: reazioni semplici e accoppiate. Metodo cinetico e amplificazione enzimatica. Dosaggio di metaboliti nella diagnostica: glucosio, colesterolo, trigliceridi, acidi grassi, lipoproteine, fosfolipidi, urea, acido urico, creatinina, bilirubina, corpi chetonici. . Luminometria: dosaggio dell’acetilcolina. Dosaggi immunoenzimatici competitivi e non competitivi (ELISA). Applicazioni dell’ELISA. Dosaggio di anticorpi, di ormoni della tiroide, delle ghiandole surrenali, dell’ipofisi e dell’ipotalamo. Dosaggio insulina e glucagone. Dosaggio troponine e mioglobina. Dosaggio di insulina e glucagone. Dosaggio di marcatori tumorali e di droghe d’abuso. Dry chemistry per il dosaggio di metaboliti nelle urine.
Dosaggio dei parametri cinetici: Km e Vmax. Rappresentazione grafica di Lineweaver-BurK, di Hanes-Woolf e di Eadie-Hofstee. Inibitori enzimatici reversibili e irreversibili. Determinazione della Ki. Chemioterapici come inibitori enzimatici. Penicillina.
Enzimi immobilizzati. Immobilizzazione fisica e chimica: vantaggi e svantaggi. Uso di amidasi immobilizzate per la preparazione di penicilline e cefalosporine semisintetiche. Biosensori. Glucometri.
DNA ricombinante: enzimi di restrizione, vettori di clonaggio. Clonaggio del DNA in plasmidi, fago lambda e cosmidi. Sonde di acidi nucleici e loro marcatura. Southern, Northern e Western blots. Sintesi enzimatica di cDNA da mRNA. Amplificazione in vitro del DNA con la reazione a catena della polimerasi (PCR). Real Time PCR. Applicazioni della PCR. Sequenziamento del DNA con metodo di Sanger. Vettori di espressione procariotici e eucariotici. Proteine di fusione. Produzione di farmaci ricombinanti: somatostatina, insulina, ormone somatotropo, vaccini, fattore VIII. Produzione di anticorpi monoclonali con la tecnica del Phage Display. Espressione genica in cellule di mammifero. Pharming. Vettori virali. Tecniche di terapia genica.
Obiettivi Agenda 2030 per lo sviluppo sostenibile
Salute e benessere
Industria, innovazione e infrastrutture
Consumo e produzione responsabili