Testi internazionali di biologia molecolare, reviews scaricabili da riviste internazionali specializzate e le diapositive presentate a lezione e distribuite durante il corso
Obiettivi Formativi
ANALISI PROTEINE
Gli studenti acquisiscono i concetti di base riguardo alle metodologie di separazione e di analisi qualitativa e quantitativa delle proteine in campioni biologici: cellule, tessuti, fluidi biologici.
Vengono in particolare approfondite le tecniche per l’analisi delle proteine mediante elettroforesi su gel mono e bidimensionale associata a DIGE. Principi di spettrometria di massa associati ad analisi proteomica.
Le lezioni pratiche integrano in particolare l’analisi preparativa per elettroforesi monodimensionale.
IMMUNOLOGIA
Gli studenti acquisiscono i concetti di base riguardo alle metodologie per purificare le diverse popolazioni cellulari ed in particolare i tipi leucocitari presenti nel sangue periferico.
Vengono fornite inoltre le principali nozioni biologiche riguardanti le cellule dendritiche ed i linfociti T, con particolare enfasi agli aspetti inerenti la loro coltura in vitro.
FONDAMENTI DI MICROSCOPIA-
Gli studenti acquisiscono i concetti di base riguardo il funzionamento del microscopio ottico, del microscopio elettronico a scansione ed a trasmissione e di alcuni microscopi ottici definiti di “nuova generazione” quali il microscopio confocale a scansione laser ed quello ad eccitazione a due fotoni. In particolare, vengono introdotti i principi teorici di base e le tecniche di allestimento dei preparati biologici per la microscopia ottica, elettronica a trasmissione, DIC, confocale a scansione laser e a eccitazione a due fotoni. Vengono fornite, inoltre, alcune nozioni di base riguardo l’allestimento e l’utilizzo delle colture cellulari sia primarie che stabilizzate. Verranno acquisite anche abilità e autonomie relative alle esperienze in laboratorio.
Prerequisiti
nessuno
Metodi Didattici
LEZIONI FRONTALI
ESERCITAZIONI PRATICHE IN LABORATORIO
Modalità di verifica apprendimento
Test scritto a risposta multipla con 31 domande da svolgere in un tempo pari a 25 minuti sulla piattaforma online https://e-val.unifi.it. Le domande proposte sono volte alla valutazione dell’apprendimento delle competenze in ambito proteomico, immunologico e microscopico, presenti nel programma e nel materiale didattico fornito dai docenti e sviluppato durante le esercitazioni in laboratorio.
Ad ogni risposta giusta verrà attribuito un punteggio pari a 1. Il punteggio finale della prova sarà il risultato della somma dei punteggi attribuiti alle singole domande. La prova si ritiene superata se la valutazione ottenuta è superiore a 18.
L’esame nella stessa sessione non si può dare più di 2 volte.
Programma del corso
ANALISI PROTEINE
Argomento 1: Tecniche di analisi delle proteine
Vengono introdotte le principali tecniche di analisi delle proteine su campione fissato e su campione estratto: immunocito- e istochimica, autoradiografia ed analisi in fluorescenza di imaging.
Array proteici su matrice. Tecnica di immunorealtime PCR per lo studio ultrasensibile delle proteine. Tecniche specifiche per lo studio dell’interazione fra proteine: immunoprecipitazione, yeast 2 hybrid assay, FRET.
Argomento 2: Analisi proteomica
Viene in particolare trattato l’approccio di analisi proteomica mediante tecnica di separazione mediante elettroforesi mono e dimensionale, analisi DIGE e analisi Western Blot. Dosaggio del contenuto proteico di un campione. Vengono illustrati esempi di ricerche sperimentali che sfruttano tale approccio proteomico. Concetto e sfruttamento della reazione antigene anticorpo per l’analisi proteica.
Argomento 3: Tecniche ELISA e Bioplex
Vengono illustrati i principi delle tecniche per l’analisi qualitativa e quantitativa contemporanea di più proteine in miscele in sospensione mediante reazione multiplex, con i relativi esempi applicativi.
IMMUNOLOGIA
Argomento 1: Purificazione cellulare da sangue periferico:
Viene introdotta la stratificazione su gradiente di densità (ficol) e la tecnica di separazione immunomagnetica basata sull’utilizzo di anticorpi monoclonali specifici per antigeni cellulari di superficie, coniugati a microbiglie ferromagnetiche.
Argomento 2: Coltura delle cellule dendritiche: vengono introdotti gli aspetti classificativi e le principali caratteristiche fenotipiche e funzionali delle cellule dendritiche. Quindi vengono illustrate le metodiche di coltura per generare le cellule dendritiche da precursori monocitari o da cellule ematopoietiche staminali
Argomento 3: Colture linfocitarie T: Dopo un breve riepilogo delle principali caratteristiche funzionali dei linfociti T, vengono introdotte le metodiche necessarie per la generazione di linee linfocitarie T specifiche per antigeni e la tecnica di clonazione dei linfociti T attraverso diluizione limite e successiva semina in piastra.
FONDAMENTI DI MICROSCOPIA-
Argomento 1: Microscopio ottico: principi di funzionamento e allestimento di campioni biologici.
Argomento 2: Microscopio elettronico a scansione e a trasmissione: principi di funzionamento e allestimento di campioni biologici. Metodiche di immuno-elettromicroscopia pre e post embedding. Il microscopio ottico a contrasto di fase.
Argomento 3: Microscopi ottici di ‘nuova generazione’: microscopio confocale a scansione laser, microscopio ad eccitazione a due fotoni. Principi di funzionamento, allestimento di preparati biologici, tecniche di immunofluorescenza confocale. Analisi di immagine.