Gli studenti acquisiscono la conoscenza teorico-pratica di modelli avanzati di colture cellulari, delle metodologie di analisi delle proteine e microscopica.
Testi internazionali di biologia molecolare, reviews scaricabili da riviste internazionali specializzate e le diapositive presentate a lezione e distribuite durante il corso
Obiettivi Formativi
ANALISI DELLE PROTEINE
Gli studenti acquisiscono i concetti di base riguardo alle metodologie di separazione e di analisi qualitativa e quantitativa delle proteine in campioni biologici: cellule, tessuti, fluidi biologici.
Vengono in particolare approfondite le tecniche per l’analisi delle proteine mediante elettroforesi su gel mono e bidimensionale associata a DIGE. Principi di spettrometria di massa associati ad analisi proteomica.
Le lezioni pratiche integrano in particolare l’analisi preparativa per elettroforesi monodimensionale.
MODELLI AVANZATI DI COLTURE CELLULARI
Gli studenti acquisiscono i concetti di base riguardo le principali nozioni biologiche per l’allestimento di colture cellulari in vitro classiche e avanzate in 3 dimensioni (sferoidi, organoidi). Vengono fornite inoltre nozioni relative alle metodologie per l’isolamento delle popolazioni epiteliale tumorale e stromale (fibroblasti, cellule immunitarie) da campioni di resezioni di pazienti.
FONDAMENTI DI MICROSCOPIA
Gli studenti acquisiscono i concetti di base riguardo il funzionamento del microscopio ottico, del microscopio elettronico a scansione ed a trasmissione e di alcuni microscopi ottici definiti di “nuova generazione” quali il microscopio confocale a scansione laser ed quello ad eccitazione a due fotoni. In particolare, vengono introdotti i principi teorici di base e le tecniche di allestimento dei preparati biologici per la microscopia ottica, elettronica a trasmissione, DIC, confocale a scansione laser e a eccitazione a due fotoni. Vengono fornite, inoltre, alcune nozioni di base riguardo l’allestimento e l’utilizzo delle colture cellulari sia primarie che stabilizzate. Gli studenti verranno coinvolti nelle fasi di acquisizione di dati con tecniche di microscopia confocale in tre dimensioni, e nelle successive elaborazioni con tecniche di machine learning. Verranno acquisite anche abilità e autonomie relative alle esperienze in laboratorio.
Prerequisiti
nessuno
Metodi Didattici
LEZIONI FRONTALI
ESERCITAZIONI PRATICHE IN LABORATORIO
Altre Informazioni
Modalità di verifica apprendimento
Test scritto misto con 27 domande a risposta multipla più una domanda libera da svolgere in un tempo pari a 30 minuti sulla piattaforma online https://e-val.unifi.it. Le domande proposte sono volte alla valutazione dell’apprendimento delle competenze in ambito proteomico, di microscopia e di modelli avanzati di colture cellulari, presenti nel programma e nel materiale didattico fornito dai docenti e sviluppato durante le esercitazioni in laboratorio.
Ad ogni risposta del test chiuso verrà attribuito un punteggio pari a 1 se corretta, pari a 0 se errata o lasciata in bianco; il punteggio della domanda aperta varierà da 0 a 4 punti. Il punteggio finale della prova sarà il risultato della somma dei punteggi attribuiti alle singole domande. La prova si ritiene superata se la valutazione ottenuta è superiore a 18; il punteggio massimo è 30 e lode.
L’esame nella stessa sessione non può essere dato più di 2 volte.
Programma del corso
ANALISI DELLE PROTEINE
Argomento 1: L’importanza dello studio delle proteine.
Vengono introdotte le principali tecniche di analisi delle proteine su campione fissato e su campione estratto. Come estrarre le proteine e misurarne il contenuto in un campione. Tecniche classiche di immunocito- e istochimica, autoradiografia ed analisi in fluorescenza di imaging. Array proteici su matrice. Tecnica di immuno-realtime PCR per lo studio ultrasensibile delle proteine.
Analisi proteomica e trascrittomica spaziale in situ e analisi single cell.
Argomento 2: Analisi proteomica.
Viene in particolare trattato l’approccio di analisi proteomica mediante tecnica di separazione mediante elettroforesi mono e bidimensionale, analisi DIGE e analisi Western Blot. Spettrometria di massa tandem associata a DIGE per identificazione delle proteine. Vengono illustrati esempi di ricerche sperimentali che sfruttano tale approccio proteomico. Concetto e sfruttamento della reazione antigene anticorpo per l’analisi proteica.
Argomento 3: Tecniche specifiche per lo studio dell’interazione fra proteine
Co-immunoprecipitazione, Yeast 2 Hybrid assay, FRET. Tecniche ELISA e Bioplex.
Vengono illustrati i principi delle tecniche per l’analisi qualitativa e quantitativa contemporanea di più proteine in miscele in sospensione mediante reazione multiplex, con i relativi esempi applicativi.
MODELLI AVANZATI DI COLTURE CELLULARI
Argomento 1: procedure relative alla generazione e mantenimento in coltura a lungo termine di organoidi derivati da tumori ( con particolare riferimento a tumori epatici). Caratteristiche che contraddistinguono gli organoidi derivati da tessuto tumorale rispetto a quelli ottenuti da tessuto sano, nonché i fattori fondamentali per favorire il mantenimento delle caratteristiche tumorali. Marcatori utilizzati per la caratterizzazione degli organoidi.
Argomento 2: metodiche relative all’isolamento di cellule epiteliali tumorali e delle principali cellule non-parenchimali (cellule di Kupffer, cellule stellate) da campione di fegato umano normale.
Argomento 3: tecniche utilizzate per lo sviluppo di tessuto epatico ingegnerizzato basate sull’utilizzo di scaffolds di matrice extracellulare. Decellularizzazione del tessuto epatico per la generazione di scaffolds derivanti da matrice extracellulare e le procedure di ripopolamento con cellule funzionali.
FONDAMENTI DI MICROSCOPIA
Argomento 1: Microscopio ottico: principi di funzionamento e allestimento di campioni biologici.
Argomento 2: Microscopio elettronico a scansione e a trasmissione: principi di funzionamento e allestimento di campioni biologici. Metodiche di immuno-elettromicroscopia pre e post embedding. Il microscopio ottico a contrasto di fase.
Argomento 3: Microscopi ottici di ‘nuova generazione’: microscopio confocale a scansione laser, microscopio ad eccitazione a due fotoni. Principi di funzionamento, allestimento di preparati biologici, tecniche di immunofluorescenza confocale. Tecniche di machine learning nell'analisi di immagine.