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SC-SALUTEUMANA Scuola di Scienze della Salute Umana
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Riassunto Tesi: La Sumoilazione degli spermatozoi umani, relazione con la frammentazione del DNA

La sumoilazione è una modifica post-traduzionale che rappresenta un esempio di controllo reversibile della funzione proteica e costituisce un meccanismo di regolazione importante in differenti tipi cellulari, incluse le cellule germinali. Essa consiste nell’aggiunta covalente di piccole proteine simili all’ubiquitina, le SUMOs (Small Ubiquitin-likeModifier) a specifici bersagli. La sumoilazione è coinvolta in vari eventi cellulari, come il trasporto citosol-nucleo, la modulazione dell’attività trascrizionale, l’integrità e la funzionalità cromosomica, i processi di riparazione del DNA, oltre alla risposta allo stress e l’apoptosi. Ad oggi, si conosce ancora poco del ruolo della sumoilazione sia durante la spermatogenesi che nelle funzioni dello spermatozoo maturo. Molti studi,però, hanno identificato SUMO1 in specifici domini cellulari sia in cellule germinali che somatiche di testicoli di topo, ratto e uomo, suggerendo, così, possibili ruoli della sumoilazione nella funzione testicolare e nella spermatogenesi. Studi su spermatozoi umani del nostro e di altri gruppi, hanno evidenziato un possibile ruolo di SUMO come marker di spermatozoi difettivi, avendo osservato un maggior livello di tale modifica in spermatozoi con morfologia anomala e/o scarsa motilità. Di recente il nostro gruppo ha identificato nuovi substrati di SUMO negli spermatozoi umani che suggeriscono l’esistenza di molteplici ruoli della sumoilazione a seconda del target e della localizzazione all’interno della cellula.

Ad esempio, i risultati ottenuti dimostrano come spermatozoi difettivi presentino una maggior sumoilazione di DRP1 (Dynamin-relatedprotein 1),proteina mitocondriale coinvolta nei processi di fusione e fissione di questi organelli. In particolare, diversi studi hanno dimostrato che una elevata sumoilazione della proteina DRP1 in cellule somatiche provoca un’alterazione e frammentazione dei mitocondri che ne pregiudica la funzione. I nostri dati suggeriscono un possibile ruolo di SUMO/DRP1 nella regolazione della funzione mitocondriale spermatica. Un’altra importante funzione della sumoilazione nelle cellule somatiche riguarda i meccanismi di induzione/riparo dei tagli al DNA. Dati ottenuti in cellule germinali(spermatociti) di topo hanno inoltre dimostrato che SUMO localizza a livello dei siti di taglio del DNA, suggerendo un ruolo della sumoilazione nei meccanismi di generazione/riparo dei danni al DNA anche a livello germinale.

Al fine di approfondire tale relazione, questo lavoro di tesi si è focalizzato sui seguenti obiettivi:

  • Verificare l’esistenza di una relazione tra sumoilazione e frammentazione del DNA negli spermatozoi umani;
  • Identificare i meccanismi alla base dell’associazione tra sumoilazione e frammentazione del DNA spermatico attraverso l’individuazione di una possibile proteina bersaglio di SUMO1 coinvolta nei meccanismi di taglio/riparazione dei tagli: la Topoisomerasi IIα.

Con l’impiego della citofluorimetria a flusso abbiamo analizzato frammentazione del DNA e sumoilazione spermatica in 37 soggetti, dimostrando l’esistenza di una correlazione positiva tra i due parametri (r=0.4, p=0.02). Inoltre per investigare ulteriormente questa relazione abbiamo effettuato una marcatura triparametrica per poter analizzare contemporaneamente, la frammentazione del DNA e SUMO1 negli stessi spermatozoi. I nostri dati dimostrano che il 70.6±23.1% (n=3) di spermatozoi positivi a SUMO1 presentano anche DNA frammentato. Per appurare ulteriormente questa associazione abbiamo analizzato i due parametri in seguito all’induzione di uno stress in grado di indurre tagli al DNA, quale una procedura di congelamento e scongelamento degli spermatozoi. In tutti i campioni da noi valutati (n=6) sia i livelli di frammentazione del DNA che quelli di SUMO1 aumentano dopo tali stimoli.

La Topoisomerasi IIα, che in diversi lavori è stata individuata come un substrato di SUMO sia nelle cellule somatiche che negli spermatociti di topo, è un enzima coinvolto nel rimodellamento della cromatina durante la spermiogenesi, introducendo tagli a doppio filamento al DNA e promuovendo così la sostituzione degli istoni con le protamine. Sulla base di queste conoscenze si è ipotizzato che tale enzima fosse anche un bersaglio di SUMO negli spermatozoi maturi. Mediante esperimenti di immunoprecipitazione, western blot e microscopia confocale, si è constatato, effettivamente, che la Topoisomerasiasi IIα viene sumoilata rappresentando così un target di SUMO1 in spermatozoi maturi.
Inoltre per verificare se vi fosse un coinvolgimento del suddetto enzima nella formazione del binomio sumoilazione-frammentazione del DNA abbiamo analizzato, mediante microscopia confocale, se la colocalizzazione tra SUMO1 e Topoisomerasi IIα subisse dei cambiamenti in seguito a condizioni stressanti come quelli del congelamento/scongelamento che portano ad un aumento sia della sumoilazione che della frammentazione del DNA. Tale procedura ha determinato un aumento della percentuale di spermatozoi che mostrano co-localizzazione tra TopoisomerasiIIα e SUMO1 (32.9±6.1% vs. 50.7±10.6%, p=0.04) rispetto ai livelli basali. In conclusione questo studio avvalora l’esistenza di un’associazione positiva tra frammentazione del DNA e sumoilazione negli spermatozoi umani maturi, dimostrando che la maggior parte degli spermatozoi sumoilati sono anche frammentati e che entrambi i parametri aumentano in condizione di stress. Inoltre, i nostri risultati evidenziano un possibile coinvolgimento della TopoisomerasiIIα e della sua sumoilazione nell’induzione/riparo del danno al DNA.

 

Candidata: Debora Aliberti
Relatore: Dott.ssa Elisabetta Baldi
Correlatore: Dott.ssa Sara Marchiani
Controrelatore: Dott.ssa Csilla Gabriella Krausz
 
ultimo aggiornamento: 08-Mag-2014
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